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新品推荐:细胞CDK1/CYCLIN B激酶活性光度法定量检测试剂盒

发布时间:2023-09-08 阅读:253

细胞CDK1/CYCLIN B激酶活性光度法定量检测试剂盒

主要用途

细胞CDK1/CYCLIN B激酶活性光度法定量检测试剂是一种旨在通过多肽底物,受到CDK1/CYCLIN B磷酸化后,进而由丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶连续循环法反应系统,测定产生ADP过程中,伴随的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的氧化反应, 即采用光度法测定其氧化后峰值的变化,以分析细胞裂解样品中CDK1/CYCLIN B特异活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞裂解萃取液样品(动物、人体)、部分或纯化酶样品中CDK1/CYCLIN B激酶的特异活性定量检测,以及抑制剂和激活剂的筛选。产品严格无菌,即到即用,操作简捷,性能稳定,高度敏感。

技术背景

细胞周期素依赖性激酶1(cyclin dependent kinase 1;CDK1),又称为细胞分裂周期蛋白2(cell division cycle2;CDC2)或p34cdk1,属于丝氨酸/苏氨酸激酶(serine/threonine protein kinase)家属成员之一。其为高度进化保留的激酶复合物,成熟促进因子(maturation promoting factor;MRF)中的催化亚体,含有297氨基酸,与细胞周期素B结合,允许细胞由G2期进入有丝分裂期以及由G1期进入DNA合成期,达到调节细胞生长、DNA复制、细胞分裂等。其磷酸化目标序列为 GGGRSPGRRRRK。基于底物GGGRSPGRRRRK,在ATP的存在下,受到CDK1/CYCLIN B激酶的磷酸化,获得产物磷酸化多肽,进而通过丙酮酸激酶(pyruvate kinase;PK)和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase;LDH)反应系统中,还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide;NADH)转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide;NAD),其吸光峰值的变化(340nm),来定量分析细胞周期素依赖性激酶1/细胞周期素B的特异活性。其反应方式为:

产品内容

清理液(Reagent A)         毫升

裂解液(Reagent B)         毫升

缓冲液(Reagent C)         毫升

酶促液(Reagent D)         微升

反应液(Reagent E)         微升

底物液(Reagent F)         微升

阴性液(Reagent G)         微升

产品说明书             1份

保存方式

保存清理液(Reagent A)在4℃冰箱里;其余的保存在-20℃冰箱里,严格避免光照和反复冻融;有效保证6月

用户自备

CDK1/CYCLIN B激酶:用于抑制剂筛选

1.5毫升离心管:用于样品保存的容器

15毫升锥形离心管:用于样品处理的容器

细胞刮脱棒:用于贴壁细胞脱离

(微型)台式离心机:用于细胞预处理

100微升1厘米光径比色皿或96孔板:用于光度分析操作的容器

分光光度仪或酶标仪:用于样品光度分析

实验步骤

一、 待测样品准备

1. 准备好25cm2细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞(1至5 X 106细胞)

2. 小心加入xx毫升清理液(Reagent A,覆盖生长表面

3. 小心抽去清理液

4. 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞(注意:避免使用胰酶消化

5. 加入xx毫升清理液(Reagent A,混匀细胞

6. 移入到预冷的15毫升锥形离心管(注意:悬浮细胞从这一步骤开始

7. 放进4℃台式离心机离心5分钟,速度为300g

8. 小心抽去上清液

9. 加入xx微升裂解液(Reagent B,充分混匀

10. 转移到预冷的1.5毫升离心管

11. 强力涡旋震荡15秒

12. 置于冰槽里孵育30分钟

13. 放进4℃微型台式离心机离心5分钟,速度为16000g(或13000RPM,例如eppendorf 5415)

14. 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管

15. 移取10微升进行蛋白定量检测(注意:建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒-30030.1

16. 即刻放进-70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

二、 测定准备

1. 准备好待测样品(例如细胞裂解悬液等),置于冰槽里

2. 设定好分光光度仪(温度为30℃):波长为340nm,间隔1分钟,读数6次(共5分钟),并置零

三、 背景对照测定

1. 移取65微升缓冲液(Reagent C到新的比色皿

2. 加入10微升酶促液(Reagent D

3. 加入10微升反应液(Reagent E

4. 加入10微升底物液(Reagent F

5. 放进30℃培养箱里静置3分钟

6. 加入5微升阴性液(Reagent G

7. 上下倾倒数次,混匀(限定在3秒之内)

8. 即刻放进分光光度仪检测,此为背景空对照:340波长读数0分钟 -340波长读数5分钟

四、 样品测定

1. 移取xx微升缓冲液(Reagent C到新的比色皿

2. 加入xx微升酶促液(Reagent D

3. 加入xx微升反应液(Reagent E

4. 加入xx微升底物液(Reagent F

5. 放进30℃培养箱里静置3分钟

6. 加入5微升待测样品(注意:50微克细胞裂解蛋白;样品须溶解

7. 上下倾倒数次,混匀(限定在3秒之内)

8. 即刻放进分光光度仪检测,此为样品总活性读数:340波长读数0分钟 -340波长读数5分钟

五、 计算样品活性

六、 酶标仪测定

1. 在96孔板上做好相应标记:背景对照和样品

2. 分别移取xx微升缓冲液(Reagent C到96孔板里

3. 分别加入xx微升酶促液(Reagent D

4. 分别加入xx微升反应液(Reagent E

5. 分别加入xx微升底物液(Reagent F

6. 轻轻摇动96孔板

7. 在30℃温度下孵育3分钟

8. 分别加入xx微升阴性液(Reagent G或待测样品(50微克细胞裂解悬液蛋白)到相应孔里(注意:样品须清澈

9. 轻轻摇动96孔板

10. 即刻放进酶标仪检测:0分钟读数和5分钟读数

11. 活性计算:


注意事项

1. 本产品为25次操作,包括背景操作

2. 操作时,须戴手套

3. 系统操作过程中,背景测定只需1次

4. 样品处理忌用磷酸缓冲溶液

5. 样品须澄清,至关重要

6. 加入样品启动反应后3秒内即刻光度测定

7. 测定值由高到低变化;测定可持续30分钟

8. 光度测定后,比色皿须清洗

9. 样本测定0分钟读数高于5分钟读数表明具有酶活性

10. 建议待测样本蛋白浓度为50微克/5微升(本公司提供 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒-30030.1)

11. 如果待测样品浓度过高或过低,可以调整样品浓度

12. 可以使用CDK1/CYCLIN B抑制剂(CGP74514A)作为抑制剂对照(IC50=0.025微摩尔)或阴性对照

13. CDK1/CYCLIN B激酶活性单位浓度定义:在30℃温度下,pH 7.5条件下,每分钟内能够氧化1微摩尔还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)所需的酶量作为一个活性单位

14. 本公司提供系列蛋白激酶检测试剂产品



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