石蜡切片软骨组织II型胶原蛋白免疫组化染色试剂盒说明书

HL80154.1 v.A

主要用途

石蜡切片软骨组织II型胶原蛋白免疫组化染色试剂是一种旨在使使用标准化的化学分离石蜡方法和免疫抗体显色技术，即通过抗II型多克隆抗体以及辣根过氧化物酶缀合物二抗，使用染料二氨基联苯胺染色显示棕褐色，分析存档中的石蜡包埋的组织切片中II型胶原蛋白表达和分布状况的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。主要适用于石蜡包埋的各种人体、大鼠、猿猴、猪、牛、小鼠、兔、狗、鸡、马等软骨组织细胞II型胶原蛋白分析。广泛用于软骨细胞识别、分化、异常病变的研究。产品严格无菌，即到即用，显色清晰，操作简捷，性能稳定。

技术背景

胶原蛋白（collagen）是为丰富的蛋白质家族，构成结缔组织的主要元素，包括皮肤、骨组织、筋腱（tendon）、韧带（ligament）、心脏等，在炎症过程中发生重要作用。哺乳动物组织中有超过26个类型胶原蛋白，由3个α链（甘氨酸-脯氨酸-羟脯氨酸）组成，构建稳定且牢固的三重螺旋结构（triple helical structure），抵抗各种压力，包括蛋白酶降解、热力、以及各种化学性和物理性影响。其中I型胶原蛋白为纤维状（fibrillar）胶原蛋白，由2个相同的α1链和1个α2链组成；而II型胶原蛋白限于无血管组织，例如软骨组织、眼睛的玻璃体组织、关节透明软骨（articular hyaline cartilage）等，会诱发关节炎、眼病和多软骨炎（polychondritis）等疾病。多聚II型胶原蛋白构建成人关节软骨组织的核心纤维网状结构，占三分之二干重和细胞外框架。 通过抗I型胶原蛋白多克隆抗体以及辣根过氧化物酶缀合物二抗（Peroxidase conjugated antibody）反应，进而使用染料二氨基联苯胺染色显示II型胶原蛋白软骨细胞为棕褐色。

产品内容

脱蜡液（Reagent A） 300毫升（自备）

补水液A（Reagent B） 毫升

补水液B（Reagent C） 毫升

补水液C（Reagent D） 毫升

补水液D（Reagent E） 毫升

清理液（Reagent F） 毫升

修复液（Reagent G） 毫升

封阻液（Reagent H） 毫升

一抗液（Reagent I） 毫升

二抗液（Reagent J） 毫升

显色液A（Reagent K） 微升

显色液B（Reagent L） 毫升

产品说明书 1份

保存方式

保存修复液（Reagent G）、一抗液（Reagent I）、二抗液（Reagent J）和显色液A（Reagent K）在－20℃冰箱里，严格避免反复冻融，其余的保存在4℃冰箱里；二抗液（Reagent J）和显色液A（Reagent K），避免光照；有效保证3月

用户自备

小型染色缸：用于石蜡切片的脱蜡和染色操作

盖玻片：用于抗体孵育操作

光学显微镜：用于细胞染色后观察分析

特别注意

1． 显色液A（Reagent K）和显色液B（Reagent L）必须在实验操作前即刻混匀；混匀后切忌久放不用或储存后备用；用完扔掉

2． 显色液A（Reagent K）如果出现沉淀，须过滤后再用

实验步骤

一、 脱蜡处理

1． 取出10片4至10微米厚的待测石蜡包埋的组织切片（注意：石蜡包埋前，组织切片须用10％甲醛4℃条件下，固定16小时，此步很重要）

2． （选择步骤）放进80℃烘箱，孵育30分钟

3． （选择步骤）室温下静置15分钟

4． 按下表依次放进小染色缸里孵育

5． 小心移去切片上的补水液D（Reagent E）

6． 小心加上xx微升清理液（Reagent F）在切片上，铺满整个切片样品表面

7． 室温下孵育5分钟

小心移去切片上的清理液（Reagent F）

二、样本修复处理

1． 小心加上xx微升修复液（Reagent G），铺满整个切片样品表面

2． 室温下孵育5分钟

3． 小心移去切片上的修复液（Reagent G）

4． 室温下，将切片置入xx毫升清理液（Reagent F）中孵育5分钟

5． 小心移去切片上的清理液（Reagent F）

6． 小心加上xx微升封阻液（Reagent H），铺满整个切片样品表面

7． 室温下孵育30分钟

8． 小心移去切片上的封阻液（Reagent H）

9． 室温下，将切片置入xx毫升清理液（Reagent F）中孵育5分钟

10． 小心移去切片上的清理液（Reagent F）

三、 免疫标记处理

1． 小心加上xx微升含有一抗液（Reagent I），铺满整个切片样品表面

2． 室温下，孵育1小时，保持湿润，避免干燥（注意：可以使用盖玻片盖上孵育）

3． 小心移去切片上的一抗液（Reagent I）

4． 室温下，小心将切片置入xx毫升清理液（Reagent F）中孵育2分钟

5． 小心移去切片上的清理液（Reagent F）

四、样本染色处理

在染色前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的显色液A（Reagent K）置入冰槽里融化，然后移取xx微升显色液A（Reagent K）和xx毫升显色液B（Reagent L）到2毫升离心管，充分混匀，标记为显色工作液，置于暗室。然后进行下列操作：

1． 小心加上xx微升二抗液（Reagent J）在切片上，铺满整个切片样品表面（注意：可以使用盖玻片盖上孵育）

2． 室温下孵育30分钟，避免光照

3． 小心移去切片上的二抗液（Reagent J）

4． 室温下，小心将切片置入5xx0毫升清理液（Reagent F）中孵育2分钟

5． 小心移去切片上的清理液（Reagent F）

6． 小心加上xx微升含有显色液A（Reagent K）和显色液B（Reagent L）的显色工作液，铺满整个切片样品表面

7． 室温下孵育5至30分钟，或直至样本出现棕褐色

8． 小心移去切片上含有显色液A（Reagent K）和显色液B（Reagent L）的显色工作液

9． 室温下，小心将切片置入xx毫升清理液（Reagent F）中浸泡5秒

10． 小心移去切片上的清理液（Reagent F）

11． （选择步骤）进行甲基绿或苏木素复染（注意：建议使用甲基绿复染试剂盒－40010）

12． 放上盖玻片或封片

13． 即刻在一般光学显微镜下观察：阳性细胞呈现棕褐色

注意事项

1． 本产品为10次操作

2． 操作时须戴手套，以防污染

3． 脱蜡液（Reagent A）可以使用二甲苯替代

4． 清理液（Reagent F）50毫升置于小型染色缸里，可重复使用

5． 所有操作在室温下进行

6． 每次换试剂溶液时，保持切片面基本晾干。空气中晾干状态为没有水滴，呈湿润状态，可见反光

7． 试剂溶液在切片表面时，避免有气泡存在，同时确保铺满切片表面

8． 细胞显色，避免过度，密切目测观察，控制时间

9． 细胞显色完成后，即刻进行光学显微镜观察

10． 染色参考图像如下

11． 本公司提供系列软组织检测试剂产品

质量标准

1． 本产品经鉴定性能稳定

2． 本产品经鉴定显色清晰